胃蛋白酶提取法中分離純化技術的研究進展

摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，對其在過程中的分離、純化技術展開綜述。其中，分離技術主要介紹了：鹽析法、有機溶劑沉淀法、底物親和法、透析法。純化技術主要介紹了：凝膠過濾法、透析離子交換法。綜合比較各分離純化方法的特點，得到*的分離純化方法有機溶劑與鹽析共沉淀法、膜分離技術、等電點沉淀法與底物親和法。

關鍵詞：胃蛋白酶 分離 純化  應用 

．生物提取法胃蛋白酶

1．1 工藝路線 

          （自溶、過濾）       （脫脂、去雜質）

豬胃黏膜→自溶液→上清液

（濃縮、干燥）

→胃蛋白酶成品

1.2工藝過程

（1）原材料的選擇和預處理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料時剝取的粘膜直徑大小與收率有關。一般取直徑10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜zui適宜，每頭豬胃平均剝取粘膜100g左右。（2）自溶、過濾：在夾套鍋內預先加水100升及鹽酸3.6-4升，加熱至50度時，在攪拌下加入200千克豬胃黏膜，快速攪拌使酸度均勻，保持45—48度，消化3-4小時，得自溶液。用紗布過濾除去未消化的組織尿蛋白，收集濾液。（3）脫脂、去雜質：將濾液降溫至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，攪勻后轉入沉淀脫脂器內，靜置24-48小時，使雜質沉淀，分出棄去，得脫脂酶液。（4）濃縮、干燥：取清酶液，在40℃以下減壓濃縮至原體積的1／4左右，再將濃縮液真空干燥。球磨過80-100目篩，即得胃蛋白酶粉。

2胃蛋白酶的分離技術

2.1有機溶劑法

可用于胃蛋白酶的初步提取濃縮。通常使用的有機溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、異丙酮，其沉淀蛋白質的能力為：丙酮＞異丙酮＞乙醇＞甲醇。當然此順序也不是一成不變的，因為還要受溫度、pH、離子強度等因素的影響。丙酮沉淀能力，但揮發損失多，價格較昂貴，所以工業上常采用乙醇作為沉淀劑。

胃蛋白酶提取法中分離純化技術的研究進展

2．2鹽析法

鹽析法是酶制劑工業中常用方法之一，硫酸鎂、硫酸銨、硫酸鈉是常用的鹽析劑，其中用的zui多的是硫酸銨。美國（2，701,228）改進后，用鋅鹽沉淀胃酶。當母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在5.0—5.2時幾乎全部胃酶可以用醋酸鋅沉淀，沉淀物為胃酶的鋅鹽，然后用金屬螯合劑除去鋅鹽，得15000—16000倍活力的酶，收集率為5.0%--5.5%。此法較上述有機溶劑沉淀所得的胃酶活力和得率都高。

2.3底物親和法

底物親和法是利用酶（胃蛋白酶）與其底物（酪蛋白）的親和性，從胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在pH2.5的乳酸緩沖液中充分結合，然后調pH至4（底物的等電點）沉淀底物和酶的結合物，隨后讓沉淀物再溶解于乳酸緩沖液中，添加低濃度的SDS將底物和酶分離，得到酶—SDS復合物，再進一步分離純化。陳躬瑞（2001）成功的應用此法對蛇胃蛋白酶進行了實驗室分離，得率大約為30%。與傳統的分離方法比較，此法具有簡單的優點，為后續的純化工藝避免了昂貴的活化試劑和配基的使用，同時具有較高的特異性。【2】

2.4透析法

胃蛋白酶的分離過程中還經常用到透析法。該法是利用蛋白質大分子對半透膜的不可透過性而與小分子物質及鹽分開的。由于透析主要是擴散過程，如果袋內外的鹽濃度相等，擴散就會停止，因此要經常換溶劑，一般一天換2—3次。如在冷處透析，則溶劑也要預先冷卻，避免樣品變性。透析時的鹽是否除凈，可用化學試劑或電導儀來檢測。【1】

3胃蛋白酶的純化技術

3.1凝膠過濾法

美國在20世紀60年代研究結晶為蛋白酶的 工藝時，是將75mg的胃蛋白酶原樣本溶解在8mL的蒸餾水中（pH5．0～6．0），在14℃±1。，pH2．0下，保持20min激活。然后用磺乙基Spandex G-25層析，zui后用羥基磷灰石進行色譜層析。結果表明用層析法得到的胃蛋白酶為單一物質純品。

3.2離子交換層析法

陳躬瑞等人在純化蘄蛇胃蛋白酶時將SDS沉淀后的上清液上樣到預先用0．05mol／L乙酸緩沖液（pH5．0）平衡的DEAE—TOYOPEARL離子交換色譜柱（4．6mm X 100mm）上，用0～O．25mo1／L氯化鈉梯度洗脫，流速為1ml／min。得到的酶在5O℃30min有較高的活性，有望應用于高溫食品加工中 。【2】

基于以上對胃蛋白酶的分離純化技術的比較分析可以看出，長期以來分離提取技術一直沒有取得較大的突破，用有機溶劑、鹽析等技術得到的天然胃蛋白酶產品，純度、生物活性愈將不能滿足醫藥品和工業日益增長的需要。隨著分離科學技術的不斷發展，采用新型分離技術分離胃蛋白酶已勢在必行。因此，大多數學者認為以下幾種技術是胃蛋白酶分離純化的方向。

胃蛋白酶提取法中分離純化技術的研究進展

3.2．1有機溶劑與鹽析共沉淀

有機溶劑和鹽析法都是分離純化胃蛋白酶的傳統方法，有其各自的特點。如果將有機溶劑和鹽析配合使用，不僅可以降低鹽的用量，而且可以不同程度的消除各自分離純化所帶來的問題，得到的胃蛋白酶純度和活性也會有所增加。

3.2.2膜分離技術

分離膜是一種特殊的、具有選擇性透過功能的薄層物質，能利用分子大小實現分離，從而起到濃縮和分離純化的作用。由于其可在維持原生物體系環境的條件下實現分離，并可地濃縮、富集產物，有效地去除雜質，加之操作簡單，結構緊湊、能耗低，過程簡化，無一次污染，也將成為胃蛋白酶分離純化工藝的研究方向。

3.2.3等電點沉淀法與底物親和法

胃蛋白酶具有極低的等電點（如豬胃蛋白pH1．0），但胃蛋白酶的分離純化技術中等電點沉淀法未見報道，如果此方法可實現，那將大大縮短分離純化的時間。底物親和法是分離純化胃蛋白酶的新亮點，但其工藝條件還不成熟，尤其是在分離底物和酶的復合物時，SDS的添加量有待研究。

4 結論

有人預言，21世紀將是生物技術的世紀，尤其是生物制藥技術的世紀。生物制藥被譽為21世紀的“朝陽產業”。得益于生物制藥技術的酶類藥物也日趨成熟。的胃蛋白酶分離純化工藝、技術和設備的出現，人們必將開發出的胃蛋白酶提取工藝。這對于提高功能性胃蛋白酶產品、提高率、降低成本和改善人民生活水平起著舉足輕重的作用。而胃蛋白酶單一組分的制備分離，可為胃蛋白酶的研究開發提供標準品，同時能為后期胃蛋白酶單一組分生理活性的研究提供必要的物質保障。