1. 細胞壁的消化，將細菌溫育在裂解液中去除細胞壁中的肽聚糖。通常在等滲的情況下進行此步，以防止細胞漲破釋放出染色體DNA分子。注意，革蘭氏陽性菌對裂解酶相對不敏感，需要額外的處理以使酶到達細胞壁層，例如，可采用滲透壓休克或保溫在螯合劑中，如EDTA。EDTA也能使一些細菌的脫氧核糖核酸酶失活，以防止在提取過程中，質粒DNA降解。

2. 利用強堿（NaOH）和其他試劑，如十二烷基磺酸鈉溶解細胞膜并使蛋白質部分變性。再中和此溶液使不溶性染色體DNA沉淀，質粒DNA存于溶液中。

3. 移去其他的大分子物質，特別是RNA和蛋白質，這可利用核糖核酸酶和蛋白酶進行酶促消化。另一些化學純化步驟可增加質粒DNA的純度，例如可將提取物同水飽和酚或酚/氯仿混合物混合，以除去蛋白質。再離心，DNA留在上面的水層，蛋白質則分離在下面的有機溶劑層。重復酚/氯仿提純的循環可降低樣品中這些大分子蛋白的含量到zui少。還可通過等密度的CsCl梯度離心法得到純化的DNA。

4. 利用體積分數為70%左右的乙醇沉淀DNA，離心，得到的DNA沉淀，再用體積分數為70%的乙醇洗，其中的水將除去先前階段的鹽污染。經過提純的DNA，可冷凍保存備用，或重新溶解在緩沖液中。